sobota, 9. november 2019

9. teden (28.10.−3.11.)

¿Prefieres todos esos castillos en España? ¿O la vista de tu calle desde el panel de la ventana? 

− Van Morrison


Verižna reakcija s polimerazo − PCR (Polymerase Chain Reaction) je metoda, ki omogoča kopiranje odsekov DNA s pomočjo encima DNA-polimeraze. S to metodo kloniramo DNA, ne da bi za to potrebovali žive celice.
Klasično kloniranje ima veliko pomanjkljivost in sicer, da je izredno časovno potratno ter tehnično zahtevno. Traja lahko več dni, saj so potrebne obsežne spremembe DNA za vnos v klonirni vektor. Tej fazi sledi prenos vektorja v gostujočo celico in kasneje tudi izbor ustreznih rekombinant. PCR izpopolnjuje kloniranje tako, da omogoča čiščenje specifičnega fragmenta DNA v samo nekaj urah.
Kopiranje odsekov DNA poteka tako, da uporabimo dve kratki molekuli DNA, ki sta komplementarni začetnemu in končnemu delu segmenta, ki ga želimo kopirati; dodamo encim, pufer, raztopino soli in deoksiribonukleotide (gradnike DNA). Reakcija poteka verižno; to pomeni, da jo večkrat ponovimo. Pri vsaki ponovitvi se število kopij pomnoževanega odseka podvoji; tako lahko po 20 ponovitvah reakcije iz 1 kopije DNA teoretično dobimo več kot 1 milijon kopij. Temperatura reakcije se mora kontrolirano spreminjati. Za vezavo kratkih molekul DNA (začetnih oligonukleotidov) na matrico, ki jo želimo pomnoževati, je namreč nujno, da je matrica v enoverižni obliki, to pa dosežemo tako, da DNA za kratek čas segrejemo na 92 °C ali več (to stopnjo imenujemo denaturacija DNA). Da pride do prileganja začetnih oligonukleotidov na matrico je treba temperaturo spet znižati (na 55°C−65°C), nato pa spet prilagoditi pogojem, ki so optimalni za delovanje DNA-polimeraze.
Nekaj let po tem, ko je Kerry Mullis opisal metodo PCR, so jo drugi avtorji izpopolnili tako, da so namesto DNA-polimeraze iz bakterije Escherichia coli (ta ima optimalno temperaturo za delovanje 37 °C in pri visokih temperaturah denaturacije DNA razpade) uporabili polimerazo iz bakterije Thermus aquaticus, ki so jo našli v vročih vrelcih v ameriškem narodnem parku Yellowstone. Ta polimeraza je termostabilna: optimalno deluje pri 72 °C, prenese pa tudi kratkotrajna segrevanja nad 90 °C. Zato odtlej ni bilo več potrebno v vsakem ciklu dodati svežega encima, kar je omogočilo avtomatizacijo postopka.
PCR izvajamo v natančnih termostatih, ki jih je mogoče programirati. Določimo lahko temperature, trajanje inkubiranja, število ponovitev ciklov in podobno. Reakcije potekajo v volumnih od 20 μl do 100 μl. Pri klasični izvedbi, kakršna je še vedno najbolj pogosta (in jo uporabljamo v našem laboratoriju), po končani reakciji produkte analiziramo z elektroforezo v agaroznem gelu. Novejša izvedba, PCR v realnem času, pa omogoča sprotno zasledovanje količine nastalega produkta in je zato hitrejša, omogoča pa tudi kvantificiranje točno določene DNA v začetnem vzorcu. 

Rezultati mojega prvega PCRja v agaroznem gelu
PCR je majhna, a pomembna in učinkovita naprava

V četrtek sva Z Alijem zarezala v lubenico (buče nisva našla), se našemila in se odpravila v bližnji pub na praznovanje noči čarovnic.

Tudi vi bi bili prestrašeni
V soboto sva se z vlakom napotila v Xàtivo. Ta je bila v rimskih časih znana po laneni tkanini, ki jo omenjata celo pesnika Ovidij in Katul. V 12. stoletju so Arabci prinesli tehnologijo izdelave papirja v Xàtivo in kmalu je postala evropsko središče izdelave papirja. Je rojstni kraj dveh papežev, Kalista III. in Aleksandra VI ter slikarja Joséta Ribere.
Na žalost pa je v rokah Filipa V. Španskega utrpela temen trenutek v svoji zgodovini. Ta je med špansko nasledstveno vojno oblegal mesto in nato odredil njegov požig ter ga preimenoval v San Felipe. V spomin njegov portret visi obrnjen na glavo v lokalnem muzeju l'Almodí, kamor sva se z Alijem namenila najprej. In kljub temu, da so imeli napise zgolj v španščini in valencijanščini ter so zaposleni zelo slabo govorili angleško, so se močno potrudili obrazložiti osnove, sama pa sem bila posebej presenečena nad svojim znanjem španščine, saj sem razumela velik del napisov.


Imeli so razstavljenih tudi kar nekaj del Francisca Goye. Serija 80 gravur je predvsem satira zasnovana kot sredstvo za boj proti pregreham moških in absurdnosti človeškega vedenja. Med njimi je mogoče izpostaviti štiri teme:
  • prevare v odnosih med moškimi in ženskami (npr. prostitucija)
  • nevljudnost in nevednost (napačni nauki, lažna prepričanja, vraževerje, čarovništvo)
  • obsojanje pregrehe družbe, zlasti duhovnosti (nečimrnost, požrešnost, lenoba, poželenje, pohlep...)
  • in zlorabo moči (inkvizicija, izkoriščanje ljudi, nepoštenost zakona...)
Kakšna žrtev!
Odpeljali so jo!











Odpravila sva se na sprehod po mestu ter si (na žalost le od zunaj) ogledala bolnišnico za siromašne iz 15./16. stoletja in baziliko svete Marije, ki je bila grajena vse od 16. do 20. stoletja in je zato mešanica najrazličnejših stilov kot so renesančni, romanski, baročni.
Bazilika

Bolnišnica

Za konec sva se povzpela še na grad. V resnici je sestavljen iz dveh ločenih gradov, znanih kot "Minor" in "Major", ki segata od vzhoda do zahoda vrha gore in sta združena z precejšnjih številom vojaških objektov. Danes je vsekakor vreden občudovanja in samo predstavljamo si lahko kako veličasten je moral biti na višku svoje moči.





Ni komentarjev:

Objavite komentar

12. teden (25.11.−1.12.)

Lo mágico de casa es que se siente bien irse y se siente aún mejor volver  − Wendy Wunder Moj zadnji teden v laboratoriju je minil...