¿Prefieres todos esos castillos en España? ¿O la vista de tu calle desde el panel de la ventana?
− Van Morrison
Verižna reakcija s polimerazo − PCR (Polymerase Chain Reaction) je metoda, ki omogoča kopiranje odsekov DNA s pomočjo encima DNA-polimeraze. S to metodo kloniramo DNA, ne da bi za to potrebovali žive celice. Klasično kloniranje ima veliko pomanjkljivost in sicer, da je izredno časovno potratno ter tehnično zahtevno. Traja lahko več dni, saj so potrebne obsežne spremembe DNA za vnos v klonirni vektor. Tej fazi sledi prenos vektorja v gostujočo celico in kasneje tudi izbor ustreznih rekombinant. PCR izpopolnjuje kloniranje tako, da omogoča čiščenje specifičnega fragmenta DNA v samo nekaj urah.
Kopiranje odsekov DNA poteka tako, da uporabimo dve kratki
molekuli DNA, ki sta komplementarni začetnemu in končnemu delu segmenta, ki ga
želimo kopirati; dodamo encim, pufer, raztopino soli in deoksiribonukleotide
(gradnike DNA). Reakcija poteka verižno; to pomeni, da jo večkrat ponovimo. Pri
vsaki ponovitvi se število kopij pomnoževanega odseka podvoji; tako lahko po 20
ponovitvah reakcije iz 1 kopije DNA teoretično dobimo več kot 1 milijon kopij.
Temperatura reakcije se mora kontrolirano spreminjati. Za vezavo kratkih
molekul DNA (začetnih oligonukleotidov) na matrico, ki jo želimo pomnoževati,
je namreč nujno, da je matrica v enoverižni obliki, to pa dosežemo tako, da DNA
za kratek čas segrejemo na 92 °C ali več (to stopnjo imenujemo
denaturacija DNA). Da pride do prileganja začetnih oligonukleotidov na matrico
je treba temperaturo spet znižati (na 55°C−65°C), nato pa spet
prilagoditi pogojem, ki so optimalni za delovanje DNA-polimeraze.
Nekaj let po tem, ko je Kerry Mullis opisal metodo PCR, so
jo drugi avtorji izpopolnili tako, da so namesto DNA-polimeraze iz bakterije Escherichia
coli (ta ima optimalno temperaturo za delovanje 37 °C in pri visokih
temperaturah denaturacije DNA razpade) uporabili polimerazo iz bakterije Thermus
aquaticus, ki so jo našli v vročih vrelcih v ameriškem narodnem parku
Yellowstone. Ta polimeraza je termostabilna: optimalno deluje pri 72 °C,
prenese pa tudi kratkotrajna segrevanja nad 90 °C. Zato odtlej ni bilo več
potrebno v vsakem ciklu dodati svežega encima, kar je omogočilo avtomatizacijo
postopka.
PCR izvajamo v natančnih termostatih, ki jih je mogoče
programirati. Določimo lahko temperature, trajanje inkubiranja, število
ponovitev ciklov in podobno. Reakcije potekajo v volumnih od 20 μl do 100 μl.
Pri klasični izvedbi, kakršna je še vedno najbolj pogosta (in jo uporabljamo v
našem laboratoriju), po končani reakciji produkte analiziramo z elektroforezo v
agaroznem gelu. Novejša izvedba, PCR v realnem času, pa omogoča sprotno
zasledovanje količine nastalega produkta in je zato hitrejša, omogoča pa tudi
kvantificiranje točno določene DNA v začetnem vzorcu.
 |
| Rezultati mojega prvega PCRja v agaroznem gelu |
 |
| PCR je majhna, a pomembna in učinkovita naprava |
V četrtek sva Z Alijem zarezala v lubenico (buče nisva našla),
se našemila in se odpravila v bližnji pub na praznovanje noči čarovnic.
 |
| Tudi vi bi bili prestrašeni |
V soboto sva se z vlakom napotila v Xàtivo. Ta je bila v rimskih
časih znana po laneni tkanini, ki jo omenjata celo pesnika Ovidij in Katul. V
12. stoletju so Arabci prinesli tehnologijo izdelave papirja v Xàtivo in kmalu
je postala evropsko središče izdelave papirja. Je rojstni kraj dveh papežev, Kalista
III. in Aleksandra VI ter slikarja Joséta Ribere.
Na žalost pa je v rokah Filipa V. Španskega utrpela temen trenutek v svoji
zgodovini. Ta je med špansko nasledstveno vojno oblegal mesto in nato odredil
njegov požig ter ga preimenoval v San Felipe. V spomin njegov portret visi obrnjen
na glavo v lokalnem muzeju l'Almodí, kamor sva se z Alijem namenila najprej. In
kljub temu, da so imeli napise zgolj v španščini in valencijanščini ter so zaposleni
zelo slabo govorili angleško, so se močno potrudili obrazložiti osnove, sama pa
sem bila posebej presenečena nad svojim znanjem španščine, saj sem razumela
velik del napisov.
Imeli so razstavljenih tudi kar nekaj del Francisca Goye. Serija
80 gravur je predvsem satira zasnovana kot sredstvo za boj proti pregreham moških in absurdnosti človeškega vedenja. Med njimi je mogoče izpostaviti štiri
teme:
- prevare v odnosih med moškimi in ženskami (npr. prostitucija)
- nevljudnost in nevednost (napačni nauki, lažna prepričanja, vraževerje, čarovništvo)
- obsojanje pregrehe družbe, zlasti duhovnosti (nečimrnost, požrešnost, lenoba, poželenje, pohlep...)
- in zlorabo moči (inkvizicija, izkoriščanje ljudi, nepoštenost zakona...)
 |
| Kakšna žrtev! |
 |
| Odpeljali so jo! |
Odpravila sva se na sprehod po mestu ter si (na žalost le od zunaj)
ogledala bolnišnico za siromašne iz 15./16. stoletja in baziliko svete Marije,
ki je bila grajena vse od 16. do 20. stoletja in je zato mešanica
najrazličnejših stilov kot so renesančni, romanski, baročni.
 |
| Bazilika |
 |
| Bolnišnica |
Za konec sva se povzpela še na grad. V resnici je sestavljen iz dveh ločenih gradov, znanih kot "Minor" in "Major", ki segata od vzhoda do zahoda vrha gore in sta združena z precejšnjih številom vojaških objektov. Danes je vsekakor vreden občudovanja in samo predstavljamo si lahko kako veličasten je moral biti na višku svoje moči.
Ni komentarjev:
Objavite komentar